يعمل التحكم القابل للضبط في نشاط Cas12 على تعزيز الاكتشاف العالمي والسريع للحمض النووي في وعاء واحد-.
الناشر: جامعة العلوم والتكنولوجيا في الصين
المجلة: اتصالات الطبيعة
عامل التأثير: 14.7
باستخدام تقنية MIRA، تم تطوير طريقة عالمية للكشف عن الحمض النووي الفلوري (SURVEY)-تعتمد على هيبارين الصوديوم. أظهرت الدراسات أن هيبارين الصوديوم يمكنه تنظيم نشاط انقسام Cas12a عن طريق التدخل في عملية ربط Cas12a-crRNA. من خلال ضبط تركيز هيبارين الصوديوم، يتوافق SURVEY مع كل من تسلسلات PAM الكلاسيكية ودون المستوى الأمثل وينطبق على أنواع فرعية متعددة من Cas12. تحقق هذه الطريقة، مع وقت اكتشاف يبلغ 15-20 دقيقة فقط، حساسية ونوعية تتجاوز 95% لاكتشاف فيروس جدري القرود الزائف، وفيروس الأنفلونزا A، وفيروس السارس-CoV-2. إنها منخفضة التكلفة- وتوفر طريقة جديدة لاكتشاف نقطة الرعاية للتشخيص الميداني الطبي والمراقبة البيئية، مما يعالج التوازن الصعب بين الحساسية والخصوصية في تشخيصات كريسبر التقليدية.
1. دراسة آلية عمل هيبارين الصوديوم
تمت إضافة مسبار فلورسنت إلى نظام Cas12a-crRNA الذي يحتوي على الحمض النووي المستهدف 10 نانومتر، ولوحظت إشارة فلورسنت سريعة وهامة دون إضافة هيبارين الصوديوم. عند إضافة 0.2 ميكروغرام/مل من هيبارين الصوديوم، كانت إشارة الفلورسنت مشابهة لإشارة المجموعة الضابطة، مما يشير إلى أن هيبارين الصوديوم يثبط بشكل كبير نشاط الانقسام العابر - لـ Cas12a. 0.2 ميكروغرام/مل من هيبارين الصوديوم هو الحد الأدنى للتركيز المثبط. مع زيادة تركيز هيبارين الصوديوم من 0.2 ميكروغرام/مل إلى 0.5 ميكروغرام/مل، يتم تثبيط نشاط انقسام رابطة الدول المستقلة- تدريجيًا لـ Cas12a، وعند 0.5 ميكروغرام/مل، يتم تثبيط نشاط الانقسام العابر- بالكامل تقريبًا. أظهرت الدراسات التي أجريت على آلية عمل هيبارين الصوديوم أن مجموعات هيبارين الصوديوم ذات الشحنة السالبة تتداخل مع الارتباط الصحيح لـ crRNA بـ Cas12a، ويمكن أن تؤثر على تكوين المركب الثنائي crRNACas12a.
- MIRA-Cas12a-كشف وعاء واحد
بعد التحقق من صحة آلية عمل هيبارين الصوديوم، استكشف البحث استراتيجية الكشف عن وعاء واحد (MIRA-Cas12a)، تجمع بين تضخيم MIRA واكتشاف التألق بوساطة Cas12a- في أنبوب واحد.
في غياب هيبارين الصوديوم، لم تنتج مجموعة MIRA-Cas12a أي إشارة فلورية مهمة ضمن نطاق تركيز الجين المستهدف الذي يتراوح بين 0.1aM إلى 10fM. عند 40 ميكروغرام/مل من هيبارين الصوديوم، لوحظت إشارة مضان كبيرة عبر نطاق التركيز المستهدف من 1aM (≈0.6 نسخة/ميكروليتر، الحجم=30μL) إلى 10fM (≈6000 نسخة/ميكروليتر، الحجم=30μL)، مما يدل على تحسن أكثر من 10000 مرة في حساسية الكشف مقارنةً بنظام لا يحتوي على هيبارين الصوديوم.
كان تركيز قالب فيروس جدري القرود 10 fM، وتم استخدام Cas12a-crRNA (100 nM) للكشف عن الجينات المستهدفة f31 وb6r. تم إنهاء تفاعل التضخيم عند 0 و2 و4 و6 و8 و12 و16 و20 دقيقة، وتم تحليل محتوى منتج تضخيم MIRA في أوقات مختلفة على المواد الهلامية agarose. تم بعد ذلك تحليل المنتجات الناتجة على هلام الاغاروز تحت ثلاثة إعدادات مختلفة: MIRA-صوديوم الهيبارين بدون Cas12a، وMIRA-Cas12a بدون هيبارين الصوديوم، وMIRA-Cas12a مع صوديوم الهيبارين. أظهرت النتائج أنه في غياب صوديوم الهيبارين، تمت إعاقة تضخيم الحمض النووي بسبب ارتفاع نشاط انقسام رابطة الدول المستقلة- لـ Cas12a. ومع ذلك، أدت إضافة صوديوم الهيبارين إلى زيادة كبيرة في تضخيم الحمض النووي بسبب تقليل نشاط انقسام Cas12a-.
توضح المقالة أنه يمكن تحقيق طريقة عالمية للكشف عن الحمض النووي الفلورسنت (SURVEY) تعتمد على هيبارين الصوديوم باستخدام كل من تسلسل PAM الكلاسيكي وتسلسل PAM دون المستوى الأمثل. بالإضافة إلى ذلك، بالإضافة إلى LbCas12a، يتم أيضًا استخدام AsCas12a وAapCas12b على نطاق واسع في أساليب CRISPR-Dx. في النظام الذي يستخدم MIRA-AsCas12a، تمت ملاحظة التألق فقط في وجود 40 ميكروغرام/مل من هيبارين الصوديوم، مما يشير إلى أنه يمكنه اكتشاف 1fM من الجينات f31 وb6r. في غياب هيبارين الصوديوم، يستطيع MIRA-AapCas12b اكتشاف جين واحد f31 وb6r. إن إعطاء 20 ميكروجرام/مل من هيبارين الصوديوم لم يؤدي فقط إلى تسريع معدل اكتشاف MIRA-AapCas12b، ولكنه أدى أيضًا إلى تعزيز كثافة التألق. تشير هذه النتائج إلى أن طريقة -الوعاء الواحد التي تم تطويرها باستخدام جرعة هيبارين الصوديوم تنطبق أيضًا على الأنواع الفرعية الأخرى من Cas12.
