في مجال التشخيص الجزيئي، يعتبر تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) منذ فترة طويلة المعيار الذهبي للكشف عن الحمض النووي. في السنوات الأخيرة، اكتسبت تقنيات التضخيم متساوي الحرارة، المتمثلة في تضخيم بوليميريز المؤتلف (RPA)، اهتمامًا متزايدًا نظرًا لسرعتها وبساطتها وملاءمتها للاختبار-في الموقع.
على الرغم من أن كلا من PCR وRPA هما طريقتان لتضخيم الحمض النووي، إلا أنهما يختلفان بشكل كبير في مبادئ العمل ومتطلبات المعدات وسيناريوهات التطبيق، مما يجعل كل تقنية مناسبة لاحتياجات التشخيص المختلفة.
1. المبادئ الأساسية: التدوير الحراري مقابل تضخيم درجة الحرارة الثابتة-.
PCR هي عملية كيميائية حيوية قادرة على تضخيم جزيء DNA واحد إلى ملايين النسخ خلال فترة زمنية قصيرة. يعتمد التفاعل على التدوير الحراري المتكرر ويتكون من ثلاث خطوات رئيسية:
1.تمسخ (90-95 درجة) - يتم فصل الحمض النووي المزدوج-الذي تقطعت به السبل إلى خيوط مفردة.
2. التلدين (55-65 درجة) – ترتبط البادئات بالتسلسل المستهدف.
3.الامتداد (72 درجة) – يقوم بوليميراز الحمض النووي بتصنيع خيوط الحمض النووي الجديدة.
ومن خلال هذه الدورات التي يتم التحكم في درجة حرارتها، يتم تضخيم الحمض النووي المستهدف بشكل كبير وبدقة عالية. ومع ذلك، يتطلب تفاعل البوليميراز المتسلسل أدوات تدوير حرارية معقدة وعادةً ما يستغرق إكماله من ساعة إلى ساعتين.
في المقابل، يعمل RPA عند درجة حرارة ثابتة تبلغ 37-42 درجة، مما يتيح تضخيم الحمض النووي السريع دون التدوير الحراري. تعتمد التقنية على العمل المنسق لبروتينات المؤتلف، وبروتينات ربط الحمض النووي-المفردة-الشريطية، والشريط-الذي يزيح بوليميريز الحمض النووي لتحقيق تضخيم هدف محدد للغاية في ظل ظروف متساوية الحرارة.
إن بوليميراز الحمض النووي المستخدم في RPA له نشاط إزاحة حبلا ولكنه يفتقر إلى نشاط نوكلياز خارجي 5'→3'. أثناء التضخيم، تمتد البادئات الخارجية على طول حبلا القالب. عندما يواجهون مناطق - مزدوجة الجديلة تم تصنيعها من البادئات الداخلية، لا يستطيع البوليميراز تحليل الشريط السفلي وبدلاً من ذلك يقوم بإزاحته، مما يؤدي إلى توليد منتجات تضخيم جديدة.
يكتمل التفاعل بأكمله تحت درجة حرارة ثابتة، مما يلغي الحاجة إلى أجهزة معقدة ويتيح -نقطة الرعاية الحقيقية والاختبار-المعتمد على الميدان. ومن خلال دمج إنزيم النسخ العكسي، يمكن أيضًا تطبيق تقنية RPA على اكتشاف هدف الحمض النووي الريبي (RNA).
يمكن تحليل نتائج التضخيم باستخدام تنسيقات قراءات متعددة، بما في ذلك الكشف عن نقطة النهاية، ومراقبة الفلورسنت في الوقت الحقيقي-، وفحوصات التدفق الجانبي، ويمكن دمجها بشكل أكبر مع أنظمة CRISPR-Cas، أو الموائع الدقيقة، أو تسلسل الجيل التالي- (NGS) لتطوير الاختبارات المتقدمة.
سيناريوهات التطبيق: الدقة المعملية مقابل الاختبار السريع في-الموقع
لقد أصبح تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) واحدًا من أكثر تقنيات التشخيص الجزيئي قيمة ويظل المعيار الذهبي لاختبار الحمض النووي.
بفضل دقته العالية وفعاليته من حيث التكلفة وقابلية التوسع، يُستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل على نطاق واسع في التشخيص السريري والمختبرات المركزية والمؤسسات البحثية وبرامج الفحص-الواسعة النطاق، حيث تتوفر البنية التحتية والموظفين المدربين بسهولة.
ومن ناحية أخرى، توفر تقنية RPA مزايا واضحة في التشخيص السريع-في الموقع. مع اكتمال التضخيم في أقل من 20 دقيقة، والحد الأدنى من متطلبات المعدات، والتشغيل البسيط، يعد RPA مناسبًا بشكل مثالي.
- الرعاية الصحية الأولية وإعدادات الطوارئ
- الجمارك وتفتيش الحدود
- الفحص الميداني للأمراض الحيوانية والنباتية
- اختبارات السلامة البيئية والغذائية
عند دمجه مع الأجهزة المحمولة وشرائط التدفق الجانبية، يتيح RPA إجراء اختبار جزيئي سريع وموثوق خارج المختبرات التقليدية.
MIRA (التضخيم السريع متساوي الحرارة متعدد الإنزيمات)هي تقنية التضخيم متساوي الحرارة الخاصة بشركة Amp Future. إنه ينتمي إلى نفس العائلة التقنية مثل RPA وهو مستوحى من آليات إعادة تركيب الحمض النووي الطبيعي وإصلاحه، وذلك باستخدام إنزيمات وظيفية متعددة لتحقيق تضخيم سريع للحمض النووي تحت درجة حرارة ثابتة.
تستخدم MIRA نظامًا منسقًا مكونًا من خمسة إنزيمات رئيسية، بما في ذلك الهليكاز، والركومبيناز، وبروتين ربط الحمض النووي المفرد-الجدول-، وبوليميراز الحمض النووي، لتمكين:
- نطاق درجة حرارة التشغيل الواسع: 25 درجة -45 درجة
- التضخيم السريع: النتائج في غضون 20 دقيقة
- حساسية وخصوصية عالية
- تعزيز السلامة وتقليل مخاطر التلوث
MIRA عبارة عن تقنية تضخيم الحمض النووي مصممة خصيصًا للاختبار الحقيقي في-موقع ونقطة-الرعاية-.
بناءً على منصة MIRA، طورت Amp Future مجموعة شاملة من المنتجات للاختبارات في نقطة الرعاية الجزيئية السريعة، بما في ذلك:
عامل إطلاق الحمض النووي السريع:
يتم الحصول على حمض نووي قابل للتضخيم خلال 5 دقائق عند درجة حرارة الغرفة؛ تثبيط منخفض، مما يسمح بتحميل عينة كاملة تصل إلى 50 ميكرولتر؛ النقل والتخزين في درجة حرارة الغرفة، لا حاجة للحماية من الضوء.
كاشف تضخيم الحمض النووي متساوي الحرارة:
اكتمال التضخيم في 5-20 دقيقة، سريع وفعال؛ أشكال كاشف مختلفة (مسحوق مجفف بالتجميد، كريات مجهرية مجففة بالتجميد، وما إلى ذلك)؛ طرق عرض النتائج المختلفة (الرحلان الكهربائي، الفلورسنت، شرائط الاختبار).
الأجهزة المحمولة المصغرة:
أجهزة الكشف الرقمية متساوية الحرارة، وأدوات اختبار بحجم الجيب-، يمكن حملها بسهولة بيد واحدة، ومزودة ببنك طاقة، مما يحررك من قيود المختبر ويقدم اختبارًا دقيقًا للحمض النووي إلى الميدان.
شرائط اختبار مفردة/متعددة:
تم تحسينه بناءً على منهجية MIRA لتحسين التوافق؛ جنبا إلى جنب مع تكنولوجيا ميرا، وتسليط الضوء على الراحة.
محلل تضخيم الحمض النووي الآلي بالكامل:
يتطلب عملية تحميل عينة واحدة فقط للكشف الآلي بالكامل؛ حد الكشف يصل إلى نسخة واحدة؛ التضخيم متساوي الحرارة والتغطية التلقائية تقلل من خطر التلوث.
في-حزمة الاختبار السريع للموقع:
-الاختبار الفوري-في أي وقت وفي أي مكان، كل ذلك في حزمة واحدة؛ يكمل الاختبار في 30 دقيقة، دقيق وحساس.
لمزيد من المعلومات أو الحلول حول المنتج، فلا تتردد في الاتصال بنا.